以取得侧链全保护的多肽为共策画, 聘任接入溴乙酰基把手的Wang树脂手脚固相载体, 选择多肽固相合成法制备了3种模子肽, 将其用于对具有弱碱性和强亲核性的肟盐类裂解剂的研究; 遐想并制备了5种不同结构的肟铯盐, 将其用于模子肽的裂解, 并聘任空洞遵守最佳的2-吡啶甲醛肟铯盐进行裂解要求的优化. 截至标明, 肟铯盐类裂解剂不错回绝、 高效地裂解模子肽, 得到侧链全保护的多肽.

关节词：侧链全保护; 固相合成; 肟铯盐; 裂解

生物活性肽是卵白质中20种自然氨基酸以不同组成和枚举形态组成的从二肽到复杂的线性、 环形结构的不同肽类的总称, 在生存[1]、 医疗[2]、 健康[3]和食物[4]等方面占据不成取代的地位, 极具发展长进, 对其进行合成与坐褥具有弘大真义. 当今, 生物活性肽的取得主要有生物法索求[5]、 发酵[6]和化学法合成[7]. 非论是生物法照旧化学法[8], 制备进程中齐难以保握多肽活性, 其原因是某个氨基酸发生了消旋响应或者保护基偶然脱除, 可能改动其二级结构从而闭塞肽链的活性位点[9].

张开剩余93%

化学法合成多肽主要有溶液法和固相法, 与溶液法比较, 固相法合成多肽具有操作方便, 产物便于分离纯化等优点, 尤其顺应长链肽的合成. 由于生物活性肽大部分具有较长的肽链, 因此固相法合成生物活性肽是较好的聘任[10]. 然而一系列合成的要求, 如树脂和邻接把手的聘任、 氨基酸的接入以及肽链的裂解等, 齐需要左证活性肽的结构进行具体聘任[11], 以使其处于尽量回绝的制备环境.

聘任合适的固相载体是诈骗固相合成法快速、 高效合成多肽的关节[12], 当今最常用的载体树脂是Wang树脂[13]. 将把手(Linker, 又称邻接臂, 邻接桥)引入到载体上是团聚物载体应用于合成的前摘要求, 亦然聘任裂解试剂的弘大依据. Fields等[14]对肽链的裂解试剂进行了深远研究, 为幸免选择酸解、 碱解等能对肽链的侧链保护基产生显著影响的裂解形态, 亲核裂解剂是较佳聘任, 它不错在较弱的碱性要求下对肽链进行亲核垂死, 最终得到碳端游离的多肽.

肟的通式为R1R2C=NOH, C=N键的拉电子作用使肟基上的H具有一定的酸性, 被碱脱去即变成肟盐, 因此肟盐同期具有弱碱性和强亲核性. 要夺取肟基上的H使其成为肟盐需具有一定的碱性, 但碱性不宜太强. 铯是位于第六周期的碱金属(ⅠA)族元素, 由于离子半径较大, 铯与肟响应生成的肟铯盐也较轩敞, 即肟阴离子的亲核性较强, 因此本文以肟铯盐为研究对象.本文华纳固相法合成了3种模子肽手脚裂解对象, 制备了一系列肟铯盐分裂对模子肽进行裂解, 并对裂解产物进行坚硬, 还比较了裂解遵守. 左阐明验截至遴择出1种空洞遵守较好的肟铯盐, 以此肟铯盐为实验对象, 探索了最优裂解要求.

1 实验部分

1.1 实验进程

1.1.1 模子肽的合成 称取Wang树脂(3 g, 1.13 mmol/g)置于50 mL固相悖应器中, 用40 mL二氯甲烷溶胀, 在摇床上回荡3 h.抽滤撤回溶剂, 用30 mL二氯甲烷和甲醇停止洗涤树脂各3次, 再用二氯甲烷洗涤2次.

将溶胀后的树脂滚动至250 mL三口烧瓶中, 烧瓶放入冷阱中, 加入100 mL二氯甲烷, 三乙胺(4.2 g, 40.0 mmol)手脚缚酸剂. 将溴乙酰溴(6.6 g, 32.0 mmol)用60 mL二氯甲烷稀释后加至恒压滴液漏斗中. 当含有树脂的溶液温度降至低于-16 ℃时, 向烧瓶中迟缓滴加溴乙酰溴/二氯甲烷溶液, 响应体系永久通氮气保护. 滴加达成, 室温下不息响应5 h, 将溶液一起滚动至固相悖应器中, 抽滤撤回溶剂, 次第用30 mL二氯甲烷和甲醇停止洗涤树脂各2次, 用30 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和甲醇停止洗涤各2次, 再用二氯甲烷洗涤各2次. 置于干燥箱中常温下真空干燥72 h, 得3.357 g淡黄色树脂, 左证增重法计较得树脂与把手的邻接率为87.0%. 结构校正后的树脂负载量也发生了变化, 表面估算树脂的负载量为0.88 mmol/g. 负载量的计较公式如下:

称取1.1 g树脂置于25 mL多肽合成器中, 用二氯甲烷(DCM)溶胀2 h, 抽滤后用DMF洗涤(15 mL×3). 称取1.18 g Fmoc-Leu-OH(3.3 mmol)置于50 mL圆底烧瓶中, 加入适量甲醇使其完满溶化, 加入543 mg碳酸铯(1.7 mmol), 超声响应5 min, 碳酸铯完满灭绝. 旋转蒸干溶液, 加入20 mL DMF将亮氨酸铯盐完满溶化, 将溶液滚动至固相悖应器中与树脂羼杂, 在摇床上回荡响应3 h后, 类似加料1次, 不息响应3 h. 响应完成后, 抽滤撤回响应液, 用DMF和甲醇停止洗涤各3次, 再用DMF洗涤2次.

选择Kaiser试剂检测发现, 树脂情愫不变. 用哌啶(体积分数20%)的DMF溶液脱除Fmoc保护基(15 mL×2, 10 min, 20 min), 抽滤后家具次第用DMF(15 mL×3), DCM(15 mL×3)和DMF(15 mL×3)洗涤. 再次用Kaiser试剂检测, 发现树脂情愫变蓝, 领悟第一个氨基酸仍是偶联.

将1.28 g Fmoc-Phe-OH、 1.36 g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和486 mg 1-羟基苯并三唑(HOBt)溶于15 mL DMF中, 加入1.14 mL N,N-二异丙基乙胺(DIEA)活化5 min. 将溶液加入固相悖应器中, 在摇床上回荡响应3 h, 撤回溶剂. 偶联达成, 次第用DMF(15 mL×3), DCM(15 mL×3)和DMF(15 mL×3)洗涤树脂. 用Kaiser试剂检测响应完满, 脱除Fmoc保护基后用沟通的顺序偶联Boc-Ala-OH, 将树脂完满干燥后称重为1.389 g, 由增重法计较模子肽P1的合成产率为80.9%. 模子肽P2和P3的合成顺序同上, 由增重法计较P2和P3的产率分裂为82.1%和78.8%.

1.1.2 肟的制备 参照文件[15]顺序制备: 将2-吡啶甲醛(3.211 g, 30 mmol)和盐酸羟胺(3.129 g, 45 mmol)溶于60 mL水中, 加入乙酸钠(3.690 g, 45 mmol), 室温下搅动响应1 h, 过滤, 滤饼用滤液洗涤2次. 滤液放入雪柜冷藏3 h后再次过滤, 将2次所得滤饼兼并, 干燥得到2-吡啶甲醛肟2.928 g, 产率80.0%. m.p. 112.9～113.4 ℃(文件值[16]: 114 ℃).

选择沟通顺序制得3-吡啶甲醛肟2.851 g, 产率77.9%, m.p. 147.9～148.8 ℃(文件值[17]: 146～148 ℃); 制得4-吡啶甲醛肟2.712 g, 产率74.1%, m.p. 130.2～131.0 ℃(文件值[18]: 130～133 ℃).

将对二甲氨基苯甲醛(4.470 g, 30 mmol)和盐酸羟胺(3.129 g, 45 mmol)溶于60 mL酒精水溶液(体积分数60%)中, 加入氢氧化钠(1.92 g, 48 mmol), 加热回流响应4 h, 冷却, 有多数白色固体析出, 过滤, 滤饼用滤液洗涤2次, 干燥得3.764 g白色固体4-二甲氨基苯甲醛肟, 产率76.5%, m.p. 146.3～147.2 ℃(文件值[19]: 145～147 ℃).

1.1.3 肟铯盐的制备 将2-吡啶甲醛肟(2.085 g, 17.0 mmol)溶于30 mL甲醇中, 加入氢氧化铯一水合物(2.722 g, 16.2 mmol), 油浴加热回流响应4 h, 冷却后过滤, 滤饼用滤液洗涤2次, 干燥得黄色固体2-吡啶甲醛肟铯盐3.810 g, 产率92.6%, 密封保存备用.

选择沟通顺序制得3-吡啶甲醛肟铯盐5.969 g, 产率90.7%; 4-吡啶甲醛肟铯盐5.873 g, 产率94.0%; 环己酮肟铯盐2.111 g, 产率90.7%; 4-二甲氨基苯甲醛肟铯盐5.408 g, 产率90.9%, 均密封保存备用.

1.1.4 肟铯盐对模子肽的裂解 分裂用2-吡啶甲醛肟铯盐、 3-吡啶甲醛肟铯盐、 4-吡啶甲醛肟铯盐、 环己酮肟铯盐和4-二甲氨基苯甲醛肟铯盐对模子肽P1, P2和P3逐个进行裂解实验.

取2-吡啶甲醛肟铯盐(610 mg)溶于20 mL DMF中, 超声溶化制成2-吡啶甲醛肟铯盐的DMF破坏溶液(0.12 mol/L), 溶液的pH值约为9. 分裂取5 mL该溶液, 次第加入装有500 mg模子肽P1, P2和P3的3个圆底烧瓶中, 常温搅动响应12 h, 响应液分裂抽滤至3个锥形瓶中, 用2 mL DMF洗涤树脂, 再用5 mL水洗涤2次, 用柠檬酸水溶液(体积分数5%)调遣pH≈6, 溶液的黄色变浅, 静置10 min后滚动至分液漏斗中, 用乙酸乙酯萃取3次, 兼并乙酸乙酯层, 再用破坏食盐水洗涤3次, 无水硫酸钠干燥过夜. 滤掉干燥剂, 减压蒸干溶液, 得到粗家具, 经柱分离[湿法装柱, 湿法上样, V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶1]得到游离的3种模子肽. 其余4种肟铯盐裂解模子肽的实验法子同上.

1.1.5 裂解要求的优化 配制2-吡啶甲醛肟铯盐的破坏DMF溶液25 mL, 浓度为0.12 mol/L, 分裂取5 mL该溶液加入5个装有500 mg模子肽P1的小圆底烧瓶中, 常温下搅动响应, 响应本事分裂为4, 6, 8, 10和12 h. 裂解液的后惩办形态同1.2.4节, 得到游离的模子肽.

分又名取12, 24, 37, 49, 61和73 mg的2-吡啶甲醛肟铯盐溶于5 mL DMF中, 所得溶液的浓度分裂为0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.10和0.12 mol/L. 将不同浓度的裂解液分裂加入装有500 mg模子肽P1的圆底烧瓶中, 常温下搅动响应6 h, 裂解液的后惩办同1.2.4节.

2 截至与筹商

2.1 模子肽的遐想

由于氨基酸常用的侧链保护基均对弱酸较敏锐, 为了取得侧链全保护的多肽, 基于正交保护的原则, 聘任Wang树脂和Fmoc/tBu保护的战术进行固相合成[20]. 空洞斟酌实验遵守、 侧链保护情况和产物踏实性等要素, 遐想合成了3种模子肽序列.

模子肽P1: Boc-Ala-Phe-Leu-O-Linker. P1无侧链保护基, 可考据肟盐能否将肽链从树脂上裂解下来. 因其结构浅陋, 可用于对肟盐裂解最优要求的探索实验.模子肽P2: Boc-Ser(Bzl)-Leu-Ser(tBu)-O-Linker. P2独一两头的氨基酸有侧链保护基, 由于多肽两头的氨基酸更容易受到裂解试剂的影响, 因此该三肽可用于探索肟盐对侧链保护基的影响.

模子肽P3: Boc-Ser(Bzl)-Asp(OtBu)-Lys(Z)-O-Linker. P3的3个氨基酸齐带有侧链保护基, 特殊是天冬氨酸的侧链是叔丁酯保护, 对其进行裂解实验不错判断以肟盐为裂解试剂时, 侧链酯基能否经得住其碱性的影响, 从而得到侧链全保护的多肽.

2.2 树脂把手对裂解的必要性考据和裂解机理

所遐想的3种模子肽齐所以结构校正后的Wang树脂为固相载体进行合成的, 为探索此邻接把手对肟铯盐裂解遵守的影响, 另外合成了模子肽P2x. P2x的肽序列与P2完满沟通, 但它所以未邻接把手的Wang树脂为载体的3肽, 其序列为Boc-Ala-Phe-Leu-O-Wang. P2x的第一个氨基酸在4-二甲氨基吡啶(DMAP)的催化下通过缩合剂固定到树脂上, 其它合成法子与P2沟通.

为考据模子肽P2x的结构正确, 用10 mL三氟乙酸与二氯甲烷的羼杂溶液(体积比9∶1)裂解P2x 6 h后, 将裂解液过滤至25 mL圆底烧瓶中, 用氮气吹干溶剂, 剩余1/10体积溶液时, 将残液用胶头滴管移至离心管中, 加入约5.0 mL无水乙醚, 出现白色絮状千里淀, 以5000 r/min转速离心10 min, 倒去表层清液, 类似2次, 撤回大部分的杂质. 倒掉乙醚, 千里淀用一丝去离子水溶化完满, 于雪柜中冷冻5 h, 在冷冻干燥机中真空干燥10 h, 得到白色固体. MS(C12H23N3O6计较值), m/z: 306.1656(306.1587)[M+H]+, 为策画产物(其质谱信息见本文解救信息图S1).

用5 mL 2-吡啶甲醛肟铯盐的DMF溶液(0.12 mol/L)对模子肽P2x裂解12 h, 后惩办顺序同1.2.4节, 所得固体经HPLC-MS分析(见本文解救信息图S2)无策画产物峰, 独一裂解剂经后惩办生成的2-吡啶甲醛肟. MS(C6H6N2O计较值), m/z: 123.0726(123.0480)[M+H]+.

对比实验截至标明, 以结构校正的Wang树脂为载体合成的多肽可被2-吡啶甲醛肟铯盐从树脂上裂解下来; 而在沟通要求下, 以未接入把手的Wang树脂为载体合成的沟通肽链则无法被2-吡啶甲醛肟铯盐从树脂上裂解下来. 这领悟了把手的接入对肟盐裂解遵守的必要性, 若要肟盐告捷将肽链裂解, 该溴乙酰基把手是不成或缺的.

结构校正后Wang树脂邻接的溴乙酰基把手是肟铯盐亲核垂死的作用位点. 因此, 臆度2-吡啶甲醛肟铯盐对结构校正后肽树脂的裂解作用机理如Scheme 1所示.

Scheme 1：2-吡啶醛肟铯从改性酚树脂中的裂解机理

2.3 模子肽的裂解遵守

选择质谱检测了5种肟铯盐对3种模子肽的裂解产物, 截至标明齐得到了侧链全保护的模子肽, 以2-吡啶甲醛肟铯盐裂解P1, P2和P3的产物资谱图(见本文解救信息图S3～图S5)为例进行谱图融会, 截至如表1所示.

表1 ：2-吡啶醛肟铯P1、P2和P3裂解产物的质谱分析

表1截至说明肟铯盐大致将肽链从固相载体上裂解下来, 况兼裂解进程中侧链保护基均未耗损, 即得到侧链全保护的多肽. 5种肟铯盐对3种模子肽的裂解截至见表2.

表2 ：五种肟铯盐对P1、P2和P3的裂解截至

2.4 2-吡啶甲醛肟铯盐的最优裂解要求

关于肽的裂解实验, 裂解本事和裂解浓度是可控变量, 聘任这2个要素进行了最优裂解要求的探索. 由表2可知, 3-吡啶甲醛肟铯盐和2-吡啶甲醛肟铯盐的裂解产率最高, 但实验中发现3-吡啶甲醛肟铯盐在空气中扬弃一段本事容易变质发红, 因此2-吡啶甲醛肟铯盐是裂解遵守较高且性质较踏实的最优裂解剂. 将其手脚研究对象, 并聘任模子肽P1为裂解对象, 进行了裂解要求的优化.

不同裂解本事和不同裂解浓度下的产率分裂如表3和表4所示.

表3 ：不同劈解本事的产量

表4 ：不同裂解浓度的产量

由表3可知, 裂解产率与本事显著关系, 裂解4～6 h产率显著升高, 但6 h后无显著变化.自然延伸响应本事至8 h不错稍稍培植裂解产率, 但同期也延伸了响应周期, 加大了消旋等副响应发生的几率, 空洞斟酌笃定6 h为2-吡啶甲醛肟铯盐的最优裂解本事.由表4可知, 裂解产率与浓度显著正关系, 因此2-吡啶甲醛肟铯盐的最优裂解浓度是其破坏浓度, 即0.12 mol/L.

综上, 最优裂解要求是选择2-吡啶甲醛肟铯盐的DMF溶液(0.12 mol/L), 在常温下裂解6 h, 最优裂解产率为78.8%.

2.5 影响裂解性能的要素

由于肟盐对结构校正后Wang树脂的裂解形态为亲核裂解, 因此影响其裂解性能的主要要素为肟阴离子的亲核性, 肟盐的溶化度对其裂解遵守也有一定影响. 本文分裂从亲核性和溶化度两个方濒临肟盐的裂解性能进行分析筹商.

肟盐裂解剂的灵验部分是肟成盐后变成的肟阴离子, 因此只需比较几种肟盐中肟阴离子的亲核性大小. 影响亲核性的3个要素是电子云密度、 空间位阻和溶剂化效应. 实验所用5种肟盐的结构基本沟通, 空间位阻的影响不错忽略, 且均用非质子性溶剂DMF配制裂解液, 不存在溶剂化效应. 因此, 比较其亲核性的大小可简化为比较肟阴离子上电子云密度的大小.

2.5.1 芳醇性对亲核性的影响 在对二甲氨基苯甲醛肟铯盐中, 苯环上的6个碳原子变成1个大π键, 碳-氮双键也参与π共轭, 变成1个大的“π-π”共轭体系, 氮原子上邻接的氧负离子由于“p-π”共轭的吸电子效应, 所带负电荷有所减少, 电子云密度缩小.但在苯环的对位上有1个取代基, 且二甲氨基是1个供电子基团, 氮原子上的孤对电子不错顺应加多大π键共轭体系的举座电子云密度, 部分对消对氧负离子电子云密度的松开效应.

3种吡啶甲醛肟铯盐中, 氮原子和5个碳原子变成1个大π键, 相同, 碳-氮双键与之变成1个大的“π-π”共轭体系, 使氧负离子因“p-π”共轭的吸电子效应而电子云密度缩小. 然而氮原子的吸电子效应甚至六元环变成了1个缺π杂环, 即每个碳原子上的电子云密度齐比苯环上的碳原子电子云密度低, 这对氧负离子的电子云密度又有一定的松开作用. 因此, 3种类型的肟铯盐亲核性大小次第为环己酮肟铯盐>对二甲氨基苯甲醛肟铯盐>吡啶甲醛肟铯盐.

2.5.2 取代基位置对亲核性的影响 实验截至标明, 3种吡啶甲醛肟铯盐的裂解遵守也不完满沟通, 说明取代基场地位置对肟铯盐的亲核性也有影响. 在吡啶环上, 吸电子作用导致氮原子的邻位和对位碳原子的电子云密度较低, 关于间位, 由于间位效应使得其电子云密度不至于过低, 分子的共振式也不错说明这一丝.

综上, 从亲核性斟酌, 肟铯盐的裂解性能优劣规则为环己酮肟铯盐>对二甲氨基苯甲醛肟铯盐>3-吡啶甲醛肟铯盐>4-吡啶甲醛肟铯盐>2-吡啶甲醛肟铯盐.

比较实验数据发现, 5种肟铯盐的裂解遵守高下不完满与亲核性大小相符, 这说明溶化度的影响不成忽略, 通过实验测得2-吡啶甲醛肟铯盐、 3-吡啶甲醛肟铯盐、 4-吡啶甲醛肟铯盐、 环己酮肟铯盐和对二甲氨基苯甲醛肟铯盐在溶剂DMF的破坏浓度分裂为0.12, 0.10, 0.11, 0.05和0.09 mol/L. 从溶化度可知, 肟铯盐的裂解产率高下规则为2-吡啶甲醛肟铯盐>4-吡啶甲醛肟铯盐>3-吡啶甲醛肟铯盐>4-二甲氨基苯甲醛肟铯盐>环己酮肟铯盐.

由表2可知, 5种肟铯盐执行裂解产率大小规则为3-吡啶甲醛肟铯盐>2-吡啶甲醛肟铯盐>4-吡啶甲醛肟铯盐>4-二甲氨基苯甲醛肟铯盐>环己酮肟铯盐. 实验截至自然不顺应单独斟酌2种要素的任何一种截至, 但却是2种要素共同作用的截至.

3 结 论

通过对2-吡啶甲醛肟铯盐、 3-吡啶甲醛肟铯盐、 4-吡啶甲醛肟铯盐、 环己酮肟铯盐和4-二甲氨基苯甲醛肟铯盐的裂解性能进行研究发现, 5种肟铯盐均能将肽链从固相载体上裂解下来, 得到侧链全保护的多肽, 况兼具有较好的裂解遵守, 达到了回绝要求下裂解剂的要求. 对2-吡啶甲醛肟铯盐裂解模子肽P1的要求进行了优化, 截至标明, 在浓度为0.12 mol/L要求下裂解6 h不错达到最优裂解产率78.8%. 肟铯盐比肟钾盐的溶化度更好, 裂解产率更高, 这与表面臆度一致, 且实验进程中不需要用到高毒性的18-冠-6醚, 因此是对已有肟类裂解剂的一大立异.

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